香精与香料(70)—愈创木酚

愈创木酚(guaiacol)（或作愈创木酚，得名于原产自拉丁美洲的愈创树）是一种天然有机物，分子式为 C6H4(OH)(OCH3)。这种无色芳香油状化合物是木馏油的主要成分，可从愈创木树脂、松油等制取。常见的愈创木酚因暴露在空气中或光照下而呈现深色。由于木质素的分解，木柴燃烧时产生的烟雾中含有愈创木酚。许多食物因含有愈创木酚而具有特殊气味，例如烘焙咖啡豆。熏制食物的特殊风味主要属愈创木酚与丁香酚的作用。愈创木酚遇三氯化铁变为蓝色。GB 2760—96规定为暂时允许使用的食用香料。主要用于配制咖啡、香草、熏烟和烟草等型香精。

愈创木酚

IUPAC名：2-甲氧基苯酚

别名：邻甲氧基苯酚；邻苯二酚甲醚

化学性质：白色或微黄色结晶或无色至淡黄色透明油状液体。有特殊芳香气味。略溶于水和苯。易溶于甘油。与乙醇、乙醚、氯仿、油类、冰醋酸混溶。嗅觉阈值(Odor Threshold): 0.0074ppm。

制备

在自然界中愈创木酚存在于愈创树脂或松油中，在木材干馏所得的杂酚油中，愈创木酚是主要的成分，将杂酚油分馏可得该品。日本大阪精化公司以邻硝基氯苯为原料，制成邻硝基苯甲醚，进而还原为邻氨基苯甲醚，最后制得该品。我国生产方法与此大致相同。原料消耗定额：含氨基苯甲醚1250kg/t、硫酸（93%）1500kg/t、亚硝酸钠700kg/t、硫酸铜400kg/t。工业上常通过对邻苯二酚甲基化生产愈创木酚。例如用碳酸钾与硫酸二甲酯和邻苯二酚反应：

C6H4(OH)2+ (CH3O)2SO2 → C6H4(OH)(OCH3) + HO(CH3O)SO2

愈创木酚也可以通过干馏木材制得的木馏油得到其混合物。

实验室制备

愈创木酚有多种实验室制法。例如可以以邻硝基氯苯为原料，通过威廉姆逊合成法合成邻硝基苯甲醚，再还原硝基为氨基，最后通过重氮化水解反应合成最终目标产物。中国与日本企业也常用此途径工业生产愈创木酚。另一种合成愈创木酚的方法是邻苯二酚甲基化后再选择性部分水解：

C6H4(OCH3)2+ C2H5SNa → C6H4(OCH3)(ONa) + C2H5SCH3

毒性

LD50  900 mg/kg(大鼠，皮下)。LD50  3.7mg/kg(家兔，静注)。大量口服可刺激食道和胃部，以致心肌衰竭、虚脱而致死。

使用限量

FEMA(mg/kg)：软饮料0.95；冷饮0.52；糖果0.96；焙烤食品0.75。适度为限(FDA§172．515，2000)。

用途

愈创木酚在工业上用途广泛。常用愈创木酚来生产各种香料，如丁香油酚、香兰素和人造麝香。愈创木酚在医药上也有大量应用，它可被用于合成苯磺酸愈创木酚（愈创木酚磺酸钾）、用作局部麻醉剂或防腐剂，还可以祛痰和治疗消化不良。因为具有还原性，常在化妆品中少量添加作为抗氧化剂并常与增效剂、金属离子螯合剂等一同使用。因为与氧反应会显深色，愈创木酚还被用作染料。愈创木酚也用作有机合成原料及分析测定的标准物质。

相关化合物

愈创木酚与甘油形成的醚（愈创甘油醚）是常用祛痰药，又称格力特或去咳露。愈创木酚的另一种衍生物邻苯二甲醚（又称白藜芦素或藜芦醚）也是常用化工产品。

安全性

愈创木酚可被用作吸入烟雾的指示物，因为从食物中摄取的愈创木酚量远多于通过呼吸吸入的烟气中的愈创木酚含量。

愈创木酚的生物合成

1、  结合转录组和蛋白质组分析探讨酸地脂环芽孢杆菌产愈创木酚的机制

脂环芽孢杆菌(Alicyclobacillus spp.)可导致商业巴氏灭菌的果汁/饮料变质，变质的特征是形成一种独特的药用或防腐剂的异味，归因于愈创木酚。本研究旨在结合转录组学和蛋白质组学方法，揭示酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)产生愈创木酚的机制。通过RNA测序和iTRAQ分析，研究了产(含500 μM香草酸)和不产(不含香草酸)愈创木酚时，酸土脂环酸芽孢杆菌基因和蛋白表达水平的差异。共鉴定出225个差异表达基因和77个差异表达蛋白。编码香草酸脱羧酶亚基的基因vdcBCD的转录分别上调了626.47、185.01和52.81倍;它们是愈创木酚生产中上调最多的基因。苯甲酸膜转运蛋白、镰刀酸抗性蛋白、抗性-结节-分裂转运蛋白、一些ATP结合盒转运蛋白和主要促进因子超家族转运蛋白在mRNA、蛋白或两个水平上的表达均增加。说明它们参与了香草酸的吸收和愈创木酚的合成。在酸土脂环酸芽孢杆菌利用香草酸合成愈创木酚的代谢过程中，三羧酸循环途径和核糖体相关基因表达上调，而缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成相关基因表达降低。这些发现为了解愈创木酚的产生机制提供了新的思路，为果汁工业中愈创木酚的防治提供了重要的指导。

图1 愈创木酚的生物合成示意图 [1]

愈创木酚在香精行业中的应用

天然香草香精的鉴定：将香草醛降解成愈创木酚的同位素表征 [2]

本文将香兰素的同位素研究扩展到近年来发现的香兰素天然前体的新来源，以期通过生物技术方法获得天然香兰素。为了检验香草醛的同位素组成与相应芳香族片段的一致性，进行了愈创木酚选择性降解反应。实验表明，该反应可以在没有显著的同位素分馏的情况下进行，并从实验设计的结果中确定了一个优化的过程，该实验设计包括了试剂的数量、温度和实验时间。愈创木酚是碳氧同位素比值质谱(IRMS)测定的一种有趣的同位素探针。它提供了芳香片段特定的(13)C信息，并结合香兰素本身测量的(13)C值，提高了碳- IRMS的鉴定潜力。因此，阿魏酸的自然状态可以通过在甲酰位点大量消耗C来表征。同样，愈创木酚的氧-18含量是比香兰素的δ (18)O更好的鉴定工具，因为在工业或实验室程序中，它不受sp(2)氧原子与水的化学交换所改变的缺点。尽管协作研究仍是必要的，以提高delta(18)O参数的实验室间重现性，但在实验室内部可以获得一致的结果。特别表明，阿魏酸的化学氧化特征是香兰素的芳香部分的相对富集。

图2 香兰素的三大来源

图3 香兰素前体分子结构:1a, R) CH3(异丁香酚);1b, R) COOH(阿魏酸);1c, R) COCH2R '(姜黄素)。1a−c如图4所示。

人们对香草的鉴定进行了大量研究，认为从香草豆中提取的天然产品比其合成或半合成的同类产品价值高得多。稳定同位素分析，通过同位素比质谱(IRMS)和核磁共振(SNF- NMR)进行，为区分香荚兰豆和其他两个重要来源愈愈木酚和木质素提供了非常强大的工具(图2)。对香草口味的需求增加，香荚兰豆天然提取物的供应相对短缺，这催生了市场上主要调味成分香草醛的新来源的开发。这些来源主要是依然来自于天然产物的前体,其分子结构如图3中所述,R) - CH3(异丁子香酚,1a,从丁香酚的丁香油),R)羧基(阿魏酸,1 b,从米糠或甜菜浆),或R) CO-CH2-R”(姜黄素,1 c,从姜科的根)。从这些分子中得到的香兰素涉及到侧双键的氧化裂解(图4)。

图4 从阿魏酸、姜黄素或异丁香酚中提取的香草醛的新来源。

图5 香草醛降解为愈创木酚的反应式

因此，身份验证问题是双重的。首先，前体的天然状态需要验证，其次，将前体转化为香草醛的过程必须保证不经过任何化学步骤。之前的研究已经确定了甲酰基或甲氧基是否因非法操作香草醛分子而发生了任何不寻常的13C或2H富集。最近，香兰素的氧同位素比值δ18O也被提出作为区分天然样品与愈创木酚和木质素来源的有效附加参数。然而，在任何制备和纯化步骤中，香兰素甲酰基的氧原子很容易与水发生化学交换。因此，有必要开发一种新的工具来克服18O程序的这一缺点，并将香草醛降解成愈创木酚被认为是摆脱了这一缺点。考虑到鉴定标准的需要，包括香草醛的新生物技术来源，这项工作的目的还在于根据碳和氧同位素数据确定不同前体香草醛样品的置信域，并研究氧化裂解对所得分子的同位素参数的影响。(香草醛转化成愈创木酚的研究。该反应涉及到苯-甲酰键与钯的催化裂解(图4)。在一个装有冷凝器的250ml圆底烧瓶中，注入等量的香草醛(至少200mg)和1% w/w的沉积在活性炭上的钯。手动搅拌混合物，在210℃的油浴中回流2小时。然后将混合物冷却到室温30分钟，所得愈创木酚溶解在30-40毫升二氯甲烷中。然后在真空条件下，通过熔块玻璃漏斗(No. 4.))

碳同位素比值。对于来自天然前体(豆类、阿魏酸、木质素和异丁香酚)的香草醛，愈创木酚分子在13C中略有富集(样本1b除外)。计算的平均值为1.3‰。相比之下，化石前体则略有减少(≈-1‰)。这种行为表明，在合成产物中，相对于来自天然来源的相同片段，香草醛的甲酰基在13C中富集。这一观察结果与氢同位素参数的典型行为相一致，与用于合成香草醛的乙醛酸的高13C含量(~ -20‰)相一致。与Krueger和Nicol的结果一致。尽管公式1计算的δ13C(CHO)值精度有限，但可以得出结论，香草醛从非天然阿魏酸中损失的甲酰基特别高(样品4和6a-c的δ13C值在-38‰和-67‰之间)。这些结果有力地支持了从天然阿魏酸中提取香草醛的δ13C值(平均δ13C值为-36.9‰，样品4和样品6a-c)来确定其天然状态。此外，香兰素前体天然阿魏酸(δ13C) -34.4‰样品4和6a-c)与米糠阿魏酸(δ13C) -35.5‰样品的平均13C含量相似。

氧同位素比率。在实践中，氧同位素比率在认证程序中并不起重要作用。如前一节所讨论的，实验室间重复性的低水平使绝对值的比较变得复杂，结果通常必须在相对的基础上解释。此外，必须考虑到由于氧交换而丧失选择性的风险。因此，在香草醛的情况下，sp2氧原子很可能在样品的提取和制备过程中与水发生交换，香草醛本身并不是一种方便的18O-IRMS通用探针。原则上，从香草醛中提取的愈创木酚较好地避免了交换的风险。此外，其δ18O值仅为两个位置以上的平均值，表现出较高的选择性。还可以确定更多的选择性参数，但代价是要进一步降解香草醛反应。Fronza等人最近发表了三种前体的选择性δ18O值:香荚兰豆、木质素和愈创木酚。结果表明，氧同位素分析提供了有关这三个氧原子起源的有趣的机制信息。从表3的结果可以评估愈创木酚作为18O-IRMS探针在合理时间内表征整个天然、化学和生物技术来源的鉴定潜力。结果表明，直接测定的合成和半合成香草醛的18O含量(δ18O)为8.9‰，样品2a、b和3a-c)，而从大豆中提取或从天然前体中提取的香草醛(δ18O)为14.1‰，样品1a、b、4、6a c和7a、b)。这种差异可能与前体的特定性质无关，而是与提取过程的工业或实验室性质有关，因为样品2和3是商业工业产品，而其他样品是在实验室规模上制备和提取的。在严格标准化条件下获得的愈创木酚有望提供一个氧同位素探针，代表唯一的非交换性原子，因此，较少依赖于样品处理。虽然δ18O的变化范围相当有限，但可以得出结论，阿魏酸双键的化学氧化使香草醛的δ18O值比水溶液中酶的反应略有增加。

考虑到香草醛的经济重要性和引进新的生物技术来源，人们对发展鉴定标准继续有兴趣。当提取的样品数量足够多时，SNIF-NMR方法对于区分香草醛的主要来源特别有效。然而，面对日益复杂的欺诈行为和对稀释介质进行调查的需要，也可以利用内部质谱仪测定碳和氧同位素比率。本研究结果扩展了之前的研究，表明以香草醛为原料制备愈创木酚，在可重复同位素条件下，为测定碳氧同位素比值提供了一种新的探针，不受甲酰氧交换的干扰。当愈创木酚的结果与测定香草醛的同位素比率相结合时，也可以获得甲酰基的同位素含量信息。结果表明，所建立的将香兰素降解成愈创木酚的实验方法是可靠、准确的。结果表明，愈创木酚的δ13C值与香草醛的δ13C值的均方差(MSD)为1.77，说明愈创木酚是鉴定香草醛前体的一个很好的补充指标。

愈创木酚的药理活性

1、  抗氧化剂愈创木酚对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)生长及脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产生具有杀菌和抑制作用

从干木材蒸馏得到的杂酚油的主要成分愈创木酚是一种天然抗氧化剂，广泛应用于医药和食品保鲜。然而愈创木酚的抗真菌机制尚不清楚。本研究发现愈创木酚对禾谷镰刀菌的菌丝生长、分生孢子的形成和萌发以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的生物合成具有一定的抑制作用，且呈剂量依赖关系。愈创木酚对标准菌株PH-1的中位有效浓度(EC50)值为1.838 mM。愈创木酚对孢子的产生和萌发有较强的抑制作用。愈创木酚的抗真菌作用可能与其破坏Ca2+转运通道的能力有关。此外，愈创木酚处理降低了丙二醛(MDA)水平，降低了过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，表明愈创木酚通过调节氧化反应来抑制真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)的产生。综上所述，本研究揭示了抗氧化剂在抑制禾谷镰刀菌中真菌毒素的潜力。

图6 愈创木酚抑制禾谷镰刀菌菌丝生长。(A)菌株PH-1在含愈创木酚(0-6.4 mM)的PDA平板上培养3 d，拍照并测量菌落直径;(B)愈创木酚(0-16 mM)处理下禾谷镰刀菌(禾谷镰刀菌, PH-1)菌丝形态的SEM观察[3]

不同浓度愈创木酚处理禾谷镰刀菌PH-1，愈创木酚对菌丝生长的抑制呈剂量依赖性，6.4 mM愈创木酚完全抑制菌丝生长(图6A)。愈创木酚对PH-1的EC50值为1.838 mM。此外，扫描电镜(SEM)检测了愈创木酚对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响，可以清楚地看出愈创木酚处理后菌丝形态发生了变化。与常规光滑的对照组菌丝不同，用16mM愈创木酚处理后菌丝明显崩坏(图6B)。

2、  漆酶催化合成愈创木酚寡聚物抗菌粉的研究

以漆酶为催化剂，采用酶催化聚合法制备愈创木酚低聚物。在水溶液中进行了紫外-可见光谱反应。用核磁共振和MALDI-TOF谱对其进行了表征。紫外-可见光谱观察显示，在380 ~ 530 nm范围内形成了一个新的峰，表明新物质的形成。核磁共振结果表明，酚羟基参与了聚合反应。MALDI-TOF谱显示愈创木酚寡聚物的质量平均聚合度为10，重复单元的质量为122。采用热重分析(TGA/DSC)对其热稳定性进行了研究。愈创木酚低聚物的热稳定性优于愈创木酚，这可能与愈创木酚具有较长的共轭π链有关。ABTS自由基 dot+自由基的抗氧化活性呈浓度依赖性，在800 μg/mL时达到平台。所得愈创木酚寡聚物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有一定的抑菌活性，抑菌率达99%。

图7 愈创木酚寡聚物合成的示意图 [4]

3、  愈创木酚通过阻断RANK与TRAF6和C-Src的相互作用以及抑制NF-κB、MAPK和AKT信号通路来抑制破骨细胞的形成

当归(Angelica sinensis)是一种传统的中药，几百年来一直被用于治疗骨质疏松和骨坏死等骨病。但其有效成分和作用机制尚不清楚。通过二维细胞膜色谱/C18柱/飞行时间质谱(2D CMC/C18柱/TOFMS)鉴定愈创木酚为当归的有效成分。愈创木酚在体外抑制骨髓单核细胞(BMMCs)和RAW264.7细胞的破骨细胞生成和破骨细胞功能，且呈剂量依赖性。免疫共沉淀提示愈创木酚阻断了RANK-TRAF6和RANK-C-Src的关联。愈创木酚可抑制p65、p50、IκB (NF-κB通路)、ERK、JNK、c-fos、p38 (MAPK通路)和Akt (Akt通路)的磷酸化，降低Cathepsin K、CTR、MMP-9和TRAP的表达水平。愈创木酚还抑制活化t细胞胞浆核因子1(NFATc1)的表达和rankl诱导的Ca2+变化。在体内，它通过抑制过度的破骨细胞生成来改善卵巢切除引起的骨丢失。综上所示，愈创木酚通过阻断RANK与TRAF6和C-Src的相互作用，以及抑制NF-κB、MAPK和AKT信号通路，从而抑制rankl诱导的破骨细胞形成。因此，该化合物显示出治疗破骨细胞发生相关骨疾病的潜力，包括绝经后骨质疏松症。

图8 愈创木酚提取自AS。A、2D CMC/C18色谱柱/TOFMS系统。B，愈创木酚典型2D色谱仪。C、愈创木酚分子式 [5]

通过2D BMMC/CMC/C18柱/TOFMS分析，鉴定愈创木酚为as的活性成分，发现愈创木酚具有明显的体外破骨细胞功能和破骨细胞生成抑制作用。通过阻断RANKL/ m - csf和C-Src之间的相互作用，在早期降低RANKL/ m - csf诱导的NF-κB、MAPK和AKT信号通路的激活。在体内，它显著减弱了ovx诱导的骨丢失(图9)。

图9 愈创木酚通过多种信号通路抑制破骨细胞分化和功能的机制 [5]

4、  酮洛芬与天然抗氧化剂(百里酚、薄荷醇和愈创木酚)可能互为前药的新衍生物的设计与合成

非甾体抗炎药(NSAIDs)是使用最广泛的一类药物。它们主要用于治疗骨关节炎、类风湿关节炎和其他炎性疾病。然而，非甾体抗炎药的使用是有限的，因为可能诱发胃肠道糜烂和溃疡。近年来，在非甾体抗炎药治疗相关的胃溃疡形成过程中，局部活性氧(ROS)的产生起着重要作用。因此，在本研究中，非甾体抗炎药(酮洛芬)已与具有抗溃疡活性的不同抗氧化剂(百里酚、薄荷醇和愈创木酚)结合。目的是获得Ketoprfen -抗氧化衍生物的相互前药，包括:酮洛芬-百里酚(化合物I)、酮洛芬-薄荷醇(化合物II)和酮洛芬愈创木酚(化合物III)。非甾体抗炎药与抗氧化剂的相互前药被指定为作为单一化学实体产生互补药理作用，改善抗炎作用，减少溃疡的不良反应。通过FT-IR、CHNS和理化性质确定了合成方法。[6]

参考文献

[1] ZhouliWang, Yunhao Liang, Qi Wang, Hang Jia, Tianli Yue, Yahong Yuan, Zhenpeng Gao,Rui Cai,Integrated analysis of transcriptome and proteome for exploring themechanism of guaiacol production by Alicyclobacillus acidoterrestris, FoodResearch International, 2021,148,110621,doi.10.1016/j.foodres.2021.110621.

[2] Bensaid,Fatiha & Wietzerbin, Karine & Martin, Gérard. (2002). Authentication ofNatural Vanilla Flavorings: Isotopic Characterization Using Degradation ofVanillin into Guaiacol. Journal of agricultural and food chemistry. 50. 6271-5.10.1021/jf020316l.

[3] GaoTao, Zhang Yao, Shi Jianrong, Mohamed Sherif Ramzy, Xu Jianhong, Liu Xin.  The Antioxidant Guaiacol Exerts FungicidalActivity Against Fungal Growth and Deoxynivalenol Production in Fusariumgraminearum.  Frontiers in Microbiology,2021, 12, DOI.10.3389/fmicb.2021.762844

[4] NannanLi, Jing Su, Hongbo Wang, Artur Cavaco-Paulo, Production of antimicrobialpowders of guaiacol oligomers by a laccase-catalyzed synthesis reaction,Process Biochemistry,2021,111, Part 1, 213-220,doi.10.1016/j.procbio.2021.07.018.

[5] XinZhi,Chao Fang,Yanqiu Gu,Huiwen Chen,Xiaofei Chen,Jin Cui,Yan Hu,WeizongWeng,Qirong Zhou,Yajun Wang,Yao Wang,Hao Jiang,Xiaoqun Li,Liehu Cao,XiaoChen,Jiacan Su. Guaiacol suppresses osteoclastogenesis by blocking interactionsof RANK with TRAF6 and C-Src and inhibiting NF-κB, MAPK and AKT pathways.Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2020, 24(9): 5122-5134.

[6]Shaheed, D.Q., Kareem, A., Mubarak,H., Abdul, A., Abbas, H.K., & Dakhil, M.A. (2015). DESIGN AND SYNTHESIS OFNEW DERIVATIVES OF KETOPROFEN LINKED TO NATURAL ANTIOXIDANTS (THYMOL, MENTHOL& GUAIACOL) AS POSSIBLE MUTUAL PRODRUGS.