新型去异味香水的开发与设计

利用嗅觉感受器技术的气味能有效控制身体异味。

各种令人不快的气味，如身体异味，正在成为一个社会问题，部分原因是全球变暖和生活方式的多样化。根据Statista汇编的数据，到2021年，除臭剂市场的全球收入预计将达到49.302亿美元，到2025年的复合年增长率将达到5.2%。预计2021年最大的五个市场将是美国(49.3亿美元)、巴西(24.86亿美元)、德国(10.17亿美元)、英国(8.92亿美元)和法国(7.31亿美元)；

(www.Statista.com/outlook/70070100/109/deodorants/united-states#market-arpu)。

相应地，市场对各种高效除臭剂产品的需求也在迅速增加。对于它们的开发，通常使用化学除臭剂和/或具有遮蔽效果的香水来减少恶臭的技术。在恶臭掩蔽技术领域，嗅觉受体(OR)检测技术作为高通量筛选高效掩蔽剂的最新技术，受到了极大的关注。

在这项研究中，我们在这项技术的基础上，专注于抑制衰老和腋臭这两种身体恶臭。OR2C1对衰老和腋下关键气味成分(E)-2-壬烯醛、(E)-2-辛烯醛、1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮均有反应，并发现了OR2C1的潜在拮抗剂。

拮抗香味物质在感官评定中明显抑制了恶臭物质的气味强度。此外，在使用含有拮抗剂的香水的实验中，这种效果得到了明显的验证。

综上所述，利用嗅觉感受器技术成功地开发出了控制身体异味的香水。这种方法被认为是开发高性能遮蔽香料组合物的有效和快速的方法。

人体异味的分析与鉴定

为了改善生活环境，人们迫切需要对日常生活中的难闻气味进行更有效的除臭。其中，人们对体味的意识最近有所提高。

体味大致分为“身体各个部位的气味”，如口臭、脚臭、腋臭和头皮气味，以及“从躯干发出的混合气味”。众所周知，后者会随着年龄的增长而变化，而且中老年人很容易不喜欢与年龄有关的气味。这种气味被称为老化气味(Kareishu)。据报道，2-壬烯醛和2-辛烯醛等不饱和醛是这种气味的关键物质。[1] 此外，青春期后腋窝产生的特殊气味是最强烈的身体异味之一，使许多人感到恼火。据报道，1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮等乙烯基酮类化合物具有极低的气味阈值和强烈的金属气味，是腋臭的关键成分。它们对腋臭有很大的影响。[2] 图1显示了每种臭味的关键成分的化学结构。

图1 每种恶臭主要成分的化学结构

现代去臭方案

针对各种恶臭，已经开发了许多除臭方法。除臭方法一般分为生物法、化学法、物理法和感觉法。感官方法包括“遮盖”，这是各种产品中最常用的，气味被比恶臭更强烈的香味成分所掩盖。然而，过度的“遮盖”往往会因为气味过浓而让消费者感到不舒服。

我们闻到的气味是分子量约为30-300的挥发性有机化合物(气味分子)的聚合体。嗅觉感受器起到传感器的作用，检测每个气味分子。

据报道，在人类中有396种嗅觉受体，在老鼠中有1130种。[3] 关于气味分子被嗅觉感受器接受和识别气味的机制已经进行了大量的研究。最新技术使高效掩蔽剂的高通量筛选成为可能。近年来，市场上出现了一些基于调节嗅觉感受器活性技术的除臭剂产品。

在目前的工作中，我们致力于利用嗅觉感受器技术开发气味控制香料。老化气味和腋臭是体臭的全球重要代表，被选为目标气味。使用OR分析技术，我们搜索对恶臭的主要成分有反应的OR，并搜索抑制OR活性的香料。我们应用这些材料，成功地研制出了新型高效除臭香料。

克隆人嗅觉受体细胞的材料与方法

通过PCR从人类基因组DNA中克隆出398个人OR基因：女性(Promega Corporation，Madison)。将牛视紫红质N端20个氨基酸残基插入pME18S载体，并将获得的OR基因插入其下游，得到人OR基因表达载体。

荧光素酶报告基因检测

HEK293T细胞在37°C、5%CO2气氛中培养。对已报道的荧光素酶报告基因检测方法进行了改进。[4] 采用双葡萄荧光素酶检测系统(Promega)测定萤火虫和海肾虫的荧光素酶活性。用含有cAMP反应元件启动子的萤火虫荧光素酶载体pGL4.29[luc2P/Cre/hygro](Promega)检测受体活性。用含有胸苷激酶启动子的海肾虫荧光素酶载体pGL4.74[hRluc/TK](Promega)作为细胞活力和转染效率的内对照。

将受体运输蛋白1短(RTP1S)基因导入pME18S载体，增强ORS的功能表达。将50 ng的人嗅觉受体(OR)基因表达载体、10 ng的RTP1S载体、10 ng的pGL4.29和5 ng的pGL4.74用脂质体3000(Life Technologies，Carlsad，California)转染HEK293T细胞，在96个多聚D-赖氨酸涂层的孔板(BioCoat，Corning Inc.，New York)中培养24小时。

去除培养液后，用含气味的50μL CD293培养基(Life Technologies)刺激转染细胞，并添加20μM的L-谷氨酰胺。

刺激3h后，用微板式发光仪Centro LB960(Berthold Technologies GmbH，维也纳)测量其发光强度。在对恶臭成分有反应的ORs的筛选和OR2C1反应抑制剂的筛选中，细胞培养在348个涂有聚D-赖氨酸的孔板中(Viewplate，PerkinElmer，Waltham，Massachusetts)，实验规模缩小到上述数量的三分之一。用TriStar2LB942(Berthold)微板式发光仪测量其发光强度。

计算每孔萤火虫发光与雷尼拉发光的比值。嗅觉受体反应强度用倍增(FI)值表示，FI值是用气味刺激细胞的比值除以无气味刺激的比值计算出来的。

在抑制恶臭成分对OR2C1反应的实验中，它们的抑制效率用恶臭成分和拮抗剂混合物的FI值除以没有拮抗剂的FI值计算出的归一化响应值来表示。用GraphPad Prism 6进行数据分析。

感官评价方法

20个训练组按照六点法气味强度测量法进行感官评价。气味强度根据强度分为以下几类：0，无气味；1，很弱；2，弱；3，明显；4，强；5，很强。当只出现恶臭时，得分设为4。将两个棉球放入塑料瓶中，其中一个有10μL的恶臭，另一个有1μL的受试物质。测试员每闻一下瓶子，就对恶臭的强度进行评分(图2)。

图2 感官评价示意图。(a)嗅闻所用的塑料瓶；(b)如何嗅闻气味。

异味成分

老化臭味：(E)-2-壬烯醛(东京化学工业株式会社)溶于0.1wt%柠檬酸三乙酯(东京化学工业株式会社)

腋臭：1-辛烯-3-酮(东京化学工业)溶于0.1wt%柠檬酸三乙酯(东京化学工业株式会社)

异味模型

根据表2制备了含有(E)-2-壬烯醛和(E)-2-辛烯醛的老化恶臭模型(东京化学工业)和含有1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮的腋臭模型(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas)。表1中列出的酸是由东京化学工业生产的。通过添加关键成分，两种模型的臭味都达到了与实际老化臭味和腋臭高度相关的程度。

表1 (a) 老化味模型

(b) 腋臭味模型

香味模型

一种花香香水是由高砂鉴臣国际公司制作的模型香水(日本东京)。这款香水的组成原料是为了不抑制OR2C1的反应而选择的。在此模型香料中分别添加0.1-1.0%的拮抗剂。

人体ORs老化及腋臭关键成分筛查结果分析

我们筛选出对(E)-2-壬烯醛有反应的人ORs。将瞬时表达人ORS的HEK293T细胞暴露于60μM的(E)-2-壬烯醛，用荧光素酶报告基因检测其反应。OR2C1对(E)-2-壬烯醛反应强烈，OR1D2、2J2、4E2、5P3和52N2反应弱(图3)。

图3 (E)-2-壬烯醛的人ORs的筛选(注：用荧光素酶报告基因检测瞬时表达人ORs的HEK293T细胞对60μM(E)-2-壬烯醛的反应。红色条表示对倍增值为2或更大的(E)-2-壬烯醇刺激有反应的OR。X轴上带彩色条的数字(1-14、51、52和56)表示OR族，T表示TAARs)

我们证实了OR2C1对(E)-2-壬烯醛的量效关系。用不同浓度的(E)-2-壬烯醛刺激表达OR2C1的细胞或模拟细胞，用荧光素酶比色法测定它们的反应。大于10μM的(E)-2-壬烯醛(图4A)呈剂量依赖性地激活OR2C1，而模拟细胞对任何浓度的(E)-2-壬烯醛(图4A)均无反应。此外，我们还尝试将表达OR2C1的细胞应用于其他恶臭成分。结果，细胞不仅对(E)-2-辛烯醛(称为老化恶臭关键成分)，而且对1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮(称为腋臭关键成分)也表现出剂量依赖性的反应(图4B-D)。总而言之，OR2C1对所有四种恶臭成分都有反应。

图4 OR2C1和模拟细胞对老化味和腋臭关键成分的反应（注：瞬时表达OR2C1的HEK293T细胞对每个浓度的恶臭成分的反应是用荧光素酶报告基因检测的。恶臭成分为(A)(E)-2-壬烯醛；(B)(E)-2-辛烯醛；(C)1-辛烯-3-酮；(D)1，5-辛二烯-3-酮。橙色条表示OR2C1的倍增值，灰色条表示模拟的平均值。每条代表平均值±SE(n=3)）

寻找OR2C1的潜在拮抗剂

为了开发具有遮蔽作用的香料，我们筛选了800种使用(E)-2-壬烯醛的香料。我们用60μM(E)-2-壬烯醛和香料的混合物刺激表达OR2C1的细胞，并用荧光素酶测定法测定它们的反应。结果，数十种材料抑制了细胞对(E)-2-壬烯醛的反应(数据未显示)。

在这些潜在的拮抗剂中，我们选择了6种物质：1，4-二氧杂环庚烷-5，17-二酮(麝香T（高砂鉴臣国际公司的商标名），化合物1)，2-甲基-4-[(1R)-2,2,3-三甲基环丙-3-烯1-基]丁-2-烯-1-醇(辛地诺（高砂鉴臣国际公司的商标名），化合物2)、2,2,6-三甲基-α-丙基环己烷丙醇(Dextramber(高砂鉴臣国际公司的商标名)，化合物3)、桉树精油(EO)、广藿香精油(EO)和香根草精油(EO)(表2)。化合物1-3由高砂鉴臣国际香料公司制造，精油由大阪早矢仕精细化工有限公司制造。它们的抑制活性被详细确认如下。

表2 拮抗候选化合物的特征

首先，我们评价了化合物1的剂量-抑制关系。我们测定了不同浓度化合物1对60μM(E)-2-壬烯醛的反应。化合物1在30μM和100μM(图5 A)时显著降低了OR2C1对(E)-2-壬烯醛的反应。我们证实了使用(E)-2-壬烯醛发现的OR2C1拮抗剂是否也能抑制同样的受体对其他恶臭成分的反应。除了将配体改变为(E)-2-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮外，我们以与上述相同的方式进行了考察。化合物1对上述三种恶臭成分的OR2C1反应均有抑制作用，且呈剂量依赖性(图5 B-D)。

我们进一步从拮抗剂中选择了化合物2和3、桉树EO、广藿香EO和香根草EO，并评价了它们对OR2C1反应的抑制作用和对腋臭成分的抑制作用。我们用60μM(E)-2-壬烯醛或30μM-1-octen-3-one的混合物和5种不同浓度的物质分别刺激OR2C1表达的细胞，并用荧光素酶测定法测定它们的反应。所有五种材料都显著抑制了OR2C1对衰老(图6 A-E)和腋窝成分(图7 A-E)的反应。

图5 化合物1抑制OR2C1对老化味和腋臭关键成分的嗅觉反应（注：用荧光素酶报告基因分析法检测瞬时表达OR2C1的HEK293T细胞对各浓度化合物1恶臭关键成分的反应。恶臭成分为：(A)60μM(E)-2-壬烯醛；(B)60μM(E)-2-辛烯醛；(C)30μM-1-辛烯-3-酮；(D)60μM-1，5-辛二烯-3-酮。条形表示OR2C1的标准化反应值，表示为平均值±SE(n=3)。采用单因素方差分析和Dunnett‘s检验，确定控制值(仅有恶臭成分)和测试值之间差异的显著性。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns，不显著。）

图6 拮抗剂对OR2C1对(E)-2-壬烯醛反应的抑制作用（注：用荧光素酶报告基因分析法检测瞬时表达OR2C1的HEK293T细胞对60μM(E)-2-壬烯醛对各浓度拮抗剂的反应。拮抗剂为(A)化合物2，(B)化合物3，(C)桉树EO，(D)广藿香EO，(E)香根草EO。条形表示OR2C1的标准化反应值，表示为平均值±SE(n=3)。采用单因素方差分析和Dunnett‘s检验，确定对照((E)-2-壬烯醛)与试验值之间差异的意义。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns，不显著）

图7 拮抗剂对OR2C1对1-辛烯-3-酮反应的抑制作用（注：用荧光素酶报告基因分析法检测瞬时表达OR2C1的HEK293T细胞对30μM1-octen-3-one与各浓度拮抗剂的反应。拮抗剂为(A)化合物2，(B)化合物3，(C)桉树EO，(D)广藿香EO，(E)香根草EO。条形表示OR2C1的标准化反应值，表示为平均值±SE(n=3)。采用单因素方差分析和Dunnett‘s检验，确定对照(单独使用1-octen-3-one)和测试值之间差异的显著性。*p<0.001；**p<0.01；*p<0.05；ns，不显著）

感官评价

进行感官评估，以验证该拮抗剂是否在人类嗅觉中起到体味抑制剂的作用。首先，检测了一种香料对每种恶臭的感官抑制效果。化合物1、2、3和桉树EO对(E)-2-壬烯醛和1-辛烯-3-酮的气味强度有抑制作用。另一方面，水杨酸苄酯没有抑制OR2C1反应，也没有降低每种气味的强度(图8 A，B)。

接下来，进行了更多的实际测试，以验证将其应用于生产级应用的有效性。我们分别制备了含有拮抗剂的香水、老化恶臭模型和腋臭模型，它们主要由它们的关键成分组成。感官评价结果表明，该香精对模型恶臭(图8 C、D)具有良好的防臭效果。不加拮抗剂的模型香水略微降低了恶臭的强度，并以此作为对照。这些结果从实际应用的角度清楚地说明了这一点。

图8 拮抗剂对各种恶臭抑制作用的感官评价（注：感官评定由20个训练有素的评审团按照六分制气味强度测量法进行：0(无气味)至5(非常强烈)。气味与受试物的组合为：(A)(E)-2-壬醛香料；(B)1-辛烯-3-酮香料；(C)有/无拮抗剂的陈化气味模型香料；(D)有/无拮抗剂的腋臭模型香料；(B)1-辛烯-3-1-酮香料；(C)有/无拮抗剂的老化气味模型香料；(D)有/无拮抗剂的腋臭模型香料。每条代表平均值±SE(n=20)）

讨论

为了开发有效去除难闻气味的新香料，我们使用OR分析技术来寻找对恶臭关键成分有反应的ORs和降低OR活性的香料。

选择(E)-2-壬烯醛和(E)-2-辛烯醛作为陈化恶臭成分，1-辛烯-3-酮和1，5-辛二烯-3-酮作为腋臭成分。

我们发现一些ORs对(E)-2-壬烯醛F-4有反应，其中OR2C1对所有四种恶臭成分都有剂量依赖性的反应(图4 A-D)。考虑到OR2C1对辛硫醇和壬硫醇也有反应，OR2C1可能识别链长约为8-9的线性分子[5]，这些OR2C1配体彼此之间没有相似的气味。在人类嗅觉系统中，与高度依赖OR5AN1的麝香气味知觉不同，OR2C1可能并不单独对气味质量起到识别作用[6,7]。

我们筛选了抑制OR2C1对(E)-2-壬烯醛反应的芳香物质，发现了数十个候选拮抗剂。其中，化合物1抑制OR2C1对所有四种恶臭成分(图5 A-D)的活性。此外，化合物2、3和三种精油中的每一种都降低了OR2C1对(E)-2-壬烯醛和1-辛烯-3-酮(图6 A-E和图7 A-E)的反应。这表明一个拮抗剂可以掩盖多种类型的恶臭。

在感官评价中，拮抗剂还降低了老化气味和腋臭成分的气味强度(图8 A，B)。感官评价结果表明，拮抗剂确实抑制了恶臭，支持了该方法的有效性。此外，含有这些拮抗剂的香精对模型衰老和腋臭(图8 C，D)有很好的控味效果。

有趣的是，一种拮抗剂可以抑制老化气味和腋臭的恶臭。另一方面，OR2C1抑制活性的有效性与感觉评价中的掩蔽性能之间没有明显的相关性。造成这种差异的原因之一是感官评价中的挥发性等物理特性的影响。此外，与OR2C1以外的OR的交互也不能被忽略。虽然OR分析不是一种完美无缺的方法，但它对于掩蔽剂候选的选择仍然是非常有效的，而且这种方法可以显著减少开发工作量。

结论

OR2C1被发现是老化味和腋臭关键气味成分共同的受体。

利用香料发现了OR2C1的潜在拮抗剂。感官评价结果表明，拮抗香料对恶臭物质的恶臭强度有明显的抑制作用。此外，在使用含有拮抗剂的香水的实验中，这种效果也得到了明显的验证。这些结果表明，从实际应用的角度来看，该方法具有重要的意义。综上所述，利用嗅觉感受器技术，成功开发了控制人体异味的香水。这种方法被认为是开发高性能遮蔽香料组合物的有效和快速的方法。

最后，我们可能要注意到，单靠拮抗剂来控制恶臭并不容易。这是因为恶臭通常不只由一个关键成分组成。最好的解决方案是将该方法与其他控制恶臭技术结合使用，这些技术通过与整个恶臭相协调来有效地减少不适感。

将此方法应用于我们最终的香精创作中，有望在除臭方面带来新的突破。

宫原久志在日本神奈川高砂鉴臣国际香料的企业研发部门任职，电子邮件：Hisashi_Mihara@takasago.com

参考文献

1. S. Haze, Y. Gozu, S. Nakamura, Y. Kohno, K. Sawano, H. Ohta, and K. Yamazaki, J. Invest. Dermatol., 116(4) 520-524 (2001)

2. S. Iida, N. Ichinose, T. Gomi, K. Someya, K. Hirano, M. Ogura, S. Yamazaki, and K. Sakurai, J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 37(3) 195-201 (2003)

3. Y. Niimura, A. Matsui, and K. Touhara, Genome Res., 24, 1485-1496 (2014)

4. H. Zhuang and H. Matsunami, Nat. Protoc. 3, 1402–1413 (2008)

5. H. Saito, Q. Chi, H. Zhuang. H. Matsunami, and J. D. Mainland, Sci. Signal., 2(60), ra9 (2009)

6. M. Shirasu, K. Yoshikawa, Y. Takai, A. Nakashima, H. Takeuchi, H. Sakano, and K. Touhara, Neuron, 81, 165-178 (2014)

7. N. Sato-Akuhara, N. Horio, A. Kato-Namba, K. Yoshikawa, Y. Niimura, S. Ihara, M. Shirasu, and K. Touhara, J. Neurosci., 36(16), 4482-4491 (2016)